Níveis anormais de anticorpos contra sarampo-caxumba-rubéola e doenças auto-imunes do sistema nervoso central (SNC) em crianças com autismo
Revista de Ciências Biométricas
Singh VK, Lin SX, Newell E, Nelson C.
2002
Sumário
Doenças autoimunes do sistema nervoso central (SNC), especialmente contra proteína mielina básica (MBP), poderia ter um papel causal no autismo, um distúrbio neurológico do desenvolvimento. Como muitas crianças autistas têm altos níveis de anticorpos contra o sarampo, realizamos um estudo sorológico de sarampo-caxumba-rubéola e autoanticorpos do sistema nervoso central. Utilizando amostras de soro de 125 crianças autistas e 92 amostras de controle, os anticorpos foram analisados pelo teste ELISA1 e análise de imunotransferência (imunofixação) 2. Os testes ELISA demonstraram um aumento significativo nos níveis de anticorpos MPR em crianças autistas. As análises de imunofixação revelaram a presença de um anticorpo MPR incomum em 75 dos 125 soros de crianças autistas (60%) e nenhum no grupo controle. Este anticorpo era específico contra a proteína de 73-75 kD do MPR. Essa proteína, analisada com anticorpos monoclonais, foi imunopositiva contra a proteína H do sarampo, chamada hemaglutinina3, mas não contra as nucleoproteínas do sarampo e contra as proteínas virais da rubéola e caxumba. Portanto, o anticorpo MPR no soro de crianças autistas identifica a proteína H do sarampo, que é específica da subunidade da vacina. Além disso, mais de 90% dos soros de crianças autistas positivos para anticorpos contra MPR também foram positivos para autoanticorpos contra a proteína mielina básica (MBP), sugerindo uma forte associação entre MPR e doenças auto-imunes do sistema nervoso central no autismo. Essa evidência implica que uma resposta inadequada à vacina MPR, principalmente no componente sarampo, possa estar ligada à patogênese do autismo.
Introdução
O autismo é um distúrbio do sistema nervoso central do desenvolvimento de início precoce, cuja etiologia e patogênese são desconhecidas. O distúrbio causa déficits severos nas funções mentais superiores, como interação social, linguagem, comunicação, imaginação e capacidade cognitiva. Embora o autismo afete mais de meio milhão de americanos e ainda mais em todo o mundo, pouco se sabe sobre a etiologia e patogênese do distúrbio. As teorias contemporâneas incluem fatores genéticos, imunológicos, ambientais e neurológicos, além de outros fatores não identificados. A partir da regulação imunológica defeituosa em crianças autistas [10, 12, 16, 21, 23 [, foi dada atenção ao mecanismo auto-imune da patogênese do autismo [14-17, 19, 20]. Como geralmente se suspeita que doenças autoimunes sejam desencadeadas por vírus, recentemente foram realizadas investigações sorológicas para a detecção de vírus no autismo [15, 17]. Verificou-se que muitas crianças com autismo apresentam altos níveis de anticorpos contra o vírus do sarampo (VM), mas não contra o herpesvírus humano tipo 6 (HHV-6), citomegalovírus ou vírus da rubéola (RV) . Além disso, o alto nível de anticorpos contra o sarampo esteve fortemente associado à presença de autoanticorpos cerebrais, o que nos levou a postular uma associação patogenética entre o vírus do sarampo e a autoimunidade presente no autismo [15, 17]. Para determinar com mais detalhes a origem dessa infecção pelo sarampo, investigamos a possibilidade de uma resposta excessiva ou inadequada de anticorpos à vacina MPR em relação a doenças autoimunes do sistema nervoso central (SNC). Como descrito aqui, várias crianças com autismo têm níveis incomuns de anticorpos MPR e mostram uma associação temporal com autoanticorpos contra a proteína mielina básica (MBP) que tem sido usada como um marcador de auto-imunidade do SNC no autismo.
Métodos e Materiais
Realizamos um estudo de laboratório sobre anticorpos MPR e autoanticorpos MBP em soros de crianças autistas e de um grupo controle. Como este estudo foi uma extensão de nossa pesquisa em andamento, usamos amostras de soro coletadas anteriormente e criopreservadas a uma temperatura de -20 ° C [14-17]. O estudo envolveu um total de 217 crianças: 125 crianças autistas (entre 4 e 10 anos) e 92 no grupo controle (das quais 58 crianças normais entre 5 e 13 anos de idade, 6 irmãos ou irmãs normais de 6 a 9 anos e 28 crianças com idade entre 4 e 12 anos que apresentavam outros distúrbios comportamentais que não se enquadravam no espectro autístico). Os resultados das análises imunológicas mostraram que todas as crianças foram vacinadas contra MPR, mas nenhuma teve casos de febre da pele ou infecção por vírus selvagem. O diagnóstico clínico do autismo foi feito essencialmente de acordo com os padrões do DSM-IIIR, estabelecidos pela Associação Americana de Psiquiatras, Washington, DC, EUA, como descrito anteriormente [14–17]. O estudo envolveu apenas crianças com um diagnóstico determinado de autismo. O Comitê de Ética revisou e aprovou nosso protocolo de pesquisa, que incluía apenas o uso de amostras de soro humano. Durante a coleta de amostras de sangue ou por pelo menos duas semanas antes da coleta, nenhum dos pacientes autistas nem o grupo controle tiveram que tomar medicamentos como antipsicóticos ou neurolépticos. Os anticorpos MPR foram inicialmente pesquisados por um ensaio imuno-absorvente ligado a enzima (teste ELISA) para titulação sérica, mas posteriormente foram pesquisados por análise de imunofixação para rastrear o soro. Nos dois métodos de análise, a vacina MPR-II (Merck, West Point, Pensilvânia, EUA) foi usada como antígeno. Autoanticorpos contra a proteína mielina básica (MBP) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EUA) foram pesquisados por análises de imunofixação como rotina em nosso laboratório. Todos os testes imunológicos foram realizados internamente (dentro do laboratório), por motivos relacionados simplesmente à natureza específica do estudo e porque, no momento, eles não estão disponíveis em nenhuma fonte comercialmente disponível.
A pesquisa de anticorpos MPR por ELISA foi realizada com base em pesquisas anteriores conduzidas por nós usando este método [18]. Resumidamente, os micropoços de uma placa de microtitulação Costar (Corning, Corning, NY, EUA) foram revestidos com antígeno MPR dissolvido em tampão fosfato salino4 a pH 7,4. A placa foi lavada três vezes com tampão de PBF-tween a 0,05%. Pipetaram-se 100 µl / poço de tampão de fosfato salino para os micropoços brancos5 ou soro humano pré-diluído em quatro diluições nos micropoços de teste. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante uma hora. Após três lavagens com tampão PBF-tween, pipetou-se 100 µl / poço de cabra anti-IgG humana conjugado em fosfatase alcalina e diluído a 1: 500 (Sigma, St. Louis, Mo., EUA). A placa foi incubada à temperatura ambiente durante uma hora e depois lavada novamente três vezes. Subsequentemente, foi adicionada uma quantidade de 100 µl / poço de uma solução de substrato (1 mg / ml de p-nitrofenilfosfato em 50 mM de tampão de bicarbonato de sódio, pH 9.6, contendo 1 mM de cloreto de magnésio). A reação de cor foi interrompida com 20 µl / poço de NaOH 1 N e a placa foi lida a 405 nm usando um modelo de Microplate Reader 3550 (Bio-Rad, Richmond, Califórnia, EUA). Após a subtração do branco, as leituras de absorbância foram convertidas em unidades EIA arbitrárias, Enzyme ImmunoAssay: Enzyme Immunoassay (0.01 OD = 1 unidade EIA).
A análise da imunofixação foi realizada inicialmente de acordo com o método publicado por nós (17-20), usando MPR ou MBP (proteína básica principal) como antígenos de rastreamento e proteínas padrão pré-coloridas (prestadas) (Bio -RAD). Em resumo, as proteínas foram separadas em uma solução de gel pronta a usar a 12% (Bio-Rad) por eletroforese usando gel de poliacrilamida (PAGE) e dodecilsulfato de sódio (SDS)6. Eles foram então transferidos para membranas de nitrocelulose usando a técnica de sanduíche duplo, seguido pelo bloqueio com albumina sérica bovina a 1% em tampão tris salino (TBS: solução salina tamponada com tris). As membranas foram secas ao ar e colocadas à temperatura ambiente.
Para testes imunológicos, pequenas manchas de 3-4 mm de diâmetro foram incubadas por uma hora com soro adequadamente diluído de pacientes autistas ou de controle. Após quatro lavagens com TBST (tampão salino tris contendo Tween-0,05 a 20%), as manchas foram incubadas por uma hora com imunoglobulinas IgG polivalentes anti-IgG humanas conjugadas em fosfatase alcalina (polivalente anti-humano cabra conjugado com fosfatase alcalina) imunoglobulinas) (Sigma). Após quatro lavagens com TBST, as transferências foram desenvolvidas em uma solução de substrato de acordo com as instruções do fabricante do kit de substrato AP (Fosfatase Alcalina) (Bio-Rad). A reação foi considerada positiva somente se a banda azul-violeta fosse exibida. Em algumas experiências, a presença de proteínas virais nos bloqueios de MPR foi encontrada através de anticorpos monoclonais contra a hemaglutinina MV (HA), a nucleoproteína MV-NP, RV ou MuV (Chemicon International, Temecula, Califórnia, EUA), seguida por pesquisa imunológica através da fosfatase alcalina IgG de camundongo anti-camundongo; para todos os outros testes, as condições acima foram replicadas. Para determinar o peso molecular, realizamos simultaneamente proteínas padrão pré-coloridas de SDSPAGE (Bio-Rad) com miosina incluída (207 kD), ß-galactosidase (121 kD), albumina sérica bovina (81 kD), ovalbumina (51.2 kD ), dióxido de carbono (33.6 kD), inibidor de rizina de soja (28.6 kD), lisozima (21.1 kD) e aprotinina (7.5 kD).
Resultados
Em primeiro lugar, é importante sublinhar o fato de termos escolhido o MPR como antígeno para a triagem simplesmente porque é o antígeno imunizante quando as crianças são vacinadas com MPR. Portanto, os anticorpos contra o MPR serão uma medida exata da conversão sérica para esta vacina tri ou polivalente, em vez de anticorpos contra proteínas virais do sarampo, caxumba ou rubéola, usadas individualmente para medir a sorologia do vírus na prática de rotina. Inicialmente, para estudar os efeitos do soro diluído, o nível de anticorpos MPR foi medido por testes ELISA em soros de 24 crianças autistas, 14 crianças normais e 16 outras crianças com problemas além do autismo. O resultado do teste ELISA nos níveis séricos de anticorpos MPR está resumido na Figura 1.
FIG. 1 Detecção de anticorpos MPR por teste ELISA. Os níveis de anticorpos MPR são mostrados de acordo com a diluição sérica de crianças autistas (n = 24, círculos na linha superior), crianças normais (n = 14, quadrados na linha central) e crianças com outros problemas de saúde (n = 16, triângulos, no final das contas). Estatisticamente, conforme avaliado pelo teste do aluno, o nível de anticorpos MPR é muito maior em crianças autistas. Os dados são expressos pelo erro padrão ± (erro padrão SE).
Crianças autistas, cujo soro foi testado em várias diluições, tinham um nível significativamente mais alto de anticorpos MPR do que crianças normais e aquelas com outros problemas. O maior pico (mais de sete vezes) foi observado na diluição 1:50 do soro autista. O método ELISA foi usado principalmente para determinar uma diluição apropriada do soro, que foi então avaliada às 1:50. Posteriormente, todos os soros foram analisados nessa diluição através da análise de imunofixação, pois esse método permite a análise das proteínas às quais os anticorpos estão ligados, que foi o objetivo principal do presente estudo.
A análise de imunofixação de todos os 217 soros revelou que 75 dos 125 soros autísticos, contra nenhum dos 92 soros controle, tinham anticorpos contra MPR e MBP. Como mostrado na Figura 2, os soros autistas tiveram uma reação imunopositiva a uma banda de proteínas de 73-75 kD na mancha MPR (fig. 2, linha B), enquanto o soro controle não teve essa reação (fig. 2, linha A); nenhuma outra banda de proteínas foi imunopositiva nesta análise. Além disso, a mesma banda de proteína nas transferências de MPR teve uma reação imunopositiva aos anticorpos monoclonais MV-HA (fig. 3, linha esquerda), mas não aos anticorpos monoclonais MV-NP (fig. 3, linha direita). Os borrões de MPR eram imunonegativos aos anticorpos monoclonais de RV ou MuV (Figura 4). De acordo com estudos anteriores [5, 15, 19, 20], os soros autistas continham autoanticorpos MBP de 18,5 a 20 kD (figura 2, linha D), que o peso molecular do cérebro bovino de MBP usou no presente estudo. Os soros de controle foram negativos para autoanticorpos MBP (Figura 2, linha C).
Com base nas análises de imunofixação, descobrimos que 75 em 125 (60%) das crianças autistas eram positivas para anticorpos MPR, enquanto 70 em 125 (56%) crianças autistas tinham autoanticorpos MBP (fig. 5). Nenhum desses dois tipos de anticorpos foi detectado no grupo controle (crianças saudáveis ou com outros tipos de doença). Além disso, de acordo com os dados de nossas análises de imunofixação, o grupo de crianças autistas encontrou uma correlação interessante entre anticorpos MPR e autoanticorpos MBP, ou seja, mais de 90% dos soros autistas positivos para anticorpos MPR também foram positivos para autoanticorpos MBP (fig. 5 ). Essa correlação estava ausente no grupo controle, pois as crianças nesse grupo foram negativas para anticorpos MPR e autoanticorpos MBP.
FIG. 2. Imunoblots representativos de anticorpos MPR e autoanticorpos MBP. Como descrito no texto, as proteínas nos pontos MPR e MBP foram incubadas com soro autístico ou controle e testadas com imunoglobulinas polivalentes anti-humanas de cabra conjugadas com fosfatase alcalina. Observe que os soros autistas (faixas B e D), mas não os soros de controle (faixas A e C), mostraram reações positivas para anticorpos com uma proteína de 73 a 75 kD na mancha MPR e uma proteína 18,5, 20 a 12 kD no ponto MBP, respectivamente. No gel de acrilamida a 17,5%, a banda da proteína MPR (Rf = 16,4 mm) migrou um pouco mais rápido que a albumina sérica bovina (Rf = 161 mm) em comparação com outros padrões de proteína pré-embalados (Cat. No. 0318-XNUMX, Bio-Rad).
FIG. 3. Os imunoblots de MPR representativos reagiram com anticorpos monoclonais às proteínas MV. Para este fim, as manchas de MPR foram incubadas separadamente com duas diluições (1: 100 e 1:50) de anticorpos monoclonais MV-HA ou anticorpos monoclonais MV-NP e detectadas com fosfatase alcalina IgG anti-camundongo de cabra. Observe que o anticorpo monoclonal MV-HA (pistas A e B), mas não o anticorpo monoclonal MV-NP (pistas C e D), mostrou uma reação imunopositiva com banda de 73 a 75 kD da mancha MPR.
FIG. 4. Os imunoblots representativos do MPR reagiram com anticorpos monoclonais ao RV ou MuV. As manchas de MPR de 4 sessões separadas de SDSPAGE foram incubadas com anticorpos monoclonais (diluição 1: 100) em RV ou MuV e detectadas com fosfatase alcalina IgG de camundongo anti-rato. Observe que os pontos de MPR foram negativos nesses imunoensaios.
FIG. 5. Distribuição de anticorpos MPR e MBP em crianças autistas e de controle. Após a triagem de anticorpos por imunotransferência, a porcentagem de soros positivos para anticorpos foi calculada em cada grupo de estudo. Isso foi rastreado contra a fonte de antígeno testada. Observe que apenas o grupo autista mostrou reações positivas (barras verticais), mas o grupo controle que incluiu crianças normais (caixa base 1), irmãos normais (caixa base 2) e crianças com outras doenças (caixa base 3) foi negativo.
Discussão
Vários estudos em todo o mundo sugeriram que fatores imunes, como a autoimunidade, podem desempenhar um papel fundamental na patogênese do autismo [10, 12, 14-17, 19, 20]. Há evidências de fatores de suscetibilidade imunogenética [24] e agrupamento familiar de doenças autoimunes em famílias com crianças autistas [4]. As crianças autistas apresentam numerosas anormalidades imunológicas: aumento sérico de IgG3 [16], diminuição sérica de IgA [7,12], diminuição do número e das funções dos linfócitos, em particular as células T auxiliares (CD4 +) e células assassinas naturais (NK) [10, 12, 21, 23] e aumento dos níveis plasmáticos de citocinas auto-imunes específicas, como interleucina-2, interleucina-12 e interferon-gama [4]. O aumento na frequência de alguns fatores imunogenéticos (alelo nulo C4B, haplótipo estendido B44-SC30-DR4 e região hipervariável HLA-DRb1) também foi demonstrado em algumas crianças com autismo [24]. Muitas crianças autistas têm autoanticorpos específicos de órgãos, em particular autoanticorpos contra a proteína MBP derivada de mielina do cérebro [15, 17, 19, 20]. Além disso, um número considerável de crianças autistas mostra melhorias significativas nas características autistas quando tratadas com terapia imunológica, como auto-antígeno oral [15], imunoglobulina intravenosa [7] ou fator de transferência [5]. Coletivamente, essas anormalidades imunológicas e / ou terapias imunológicas são consistentes com uma base autoimune de patogênese no autismo.
Os vírus são comumente associados a doenças autoimunes, apesar da falta de evidências experimentais. O mecanismo de gatilho da autoimunidade no autismo é desconhecido, mas associações virais foram descritas [2, 8]. Crianças autistas têm um valor significativamente mais alto do que os níveis normais de anticorpos contra o sarampo, mas não os anticorpos contra o HHV-6, a rubéola ou o citomegalovírus [15, 17]. O aumento específico no nível de anticorpos contra o sarampo também foi consistente com uma associação sorológica entre VM e autoimunidade no autismo, o que nos levou a postular uma ligação etiológica entre VM e autismo [15, 17]. Conforme relatado aqui, um aumento significativo no nível de anticorpos MPR foi encontrado em crianças autistas. Além disso, o anticorpo MPR mostrou uma reação imunopositiva a uma proteína de MPR de 73 a 75 kD em 60% das crianças autistas no estudo. Este foi um resultado importante porque o peso molecular da proteína MPR que reagiu positivamente aos anticorpos MPR se assemelhava ao peso molecular de uma proteína de sarampo conhecida como antígeno HA. De fato, a banda MPR continha o antígeno MV-HA, pois era imunopositivo para anticorpos monoclonais para MV-HA, mas não para anticorpos monoclonais para MV-NP. Em dados preliminares não incluídos aqui, descobrimos recentemente que o anticorpo monoclonal MV-HA, mas não o anticorpo monoclonal MVNP, bloqueou quase completamente a ligação do anticorpo soro anticorpo positivo (MPR) à banda de proteína MPR no immunoblot. Portanto, esses estudos indiretos sugerem que os anticorpos MPR em soros autistas têm maior probabilidade de serem direcionados ao antígeno MV HA. Além disso, a faixa de 73 a 75 kD do MPR não continha RV ou MuV, uma vez que essa banda era imunonegativa para anticorpos monoclonais para cada um desses dois vírus. Comparadas às crianças autistas, as crianças controle tinham baixos níveis de anticorpos MMR que eram imunonegativos para o antígeno MV-HA derivado de MMR. Portanto, parece plausível que crianças autistas produzam uma resposta de anticorpo inadequada ou anormal ao MDR que foi direcionada contra o antígeno MV-HA. Sem dúvida, são necessárias mais pesquisas sobre esse tópico, mas somos tentados a especular que fatores de imunorregulação ou imunogenéticos defeituosos podem determinar por que apenas crianças autistas produzem esses anticorpos anormais à proteína derivada do MPR (73-75 kD), que parece ser a Antígeno MV HA. Alternativamente, a diferença entre crianças autistas e de controle pode ser devida a uma modificação estrutural (ou mutação) do determinante antigênico reconhecido pelos anticorpos MPR. A imunização com vacinas é a melhor medida preventiva contra infecções mortais hoje disponíveis para a humanidade. Como as vacinas são administradas a indivíduos saudáveis, quase exclusivamente a crianças, a segurança da vacina deve ser o mais absoluta possível humanamente. Embora a equação risco-benefício seja a favor da vacinação, existem alguns efeitos colaterais sérios, embora extremamente raros, que merecem atenção científica. Por exemplo, meningite asséptica [6] e ataxia cerebelar [11] foram descritas em crianças imunizadas com MPR. No entanto, a base de como as vacinas reagem negativamente em alguns casos permanece praticamente desconhecida. É perfeitamente possível que vacinas em uma pequena população de crianças geneticamente predispostas reajam de forma inadequada, simplesmente por causa de seu sistema imunológico imaturo ou por outros fatores de risco desconhecidos, como imunodeficiências, alergias, toxinas químicas ou estresse psicológico crônico [3]. .
Nos últimos anos, o tema da autoimunidade de imunização ganhou alguma atenção do público. Provavelmente, isso se deve ao fato de as doenças autoimunes serem as manifestações mais comuns das vacinas [1, 13]. A MDR foi insinuada como culpada de problemas gastrointestinais em algumas crianças com características autistas [22]. Cerca de metade dos pais com filhos autistas relataram regressão autística após imunização por MPR [17]. Além disso, uma associação sorológica de VM com autoimunidade foi encontrada em crianças autistas que não tinham infecção pelo sarampo do tipo selvagem, mas tinham imunização por MPR [17]. E, como descrito aqui, crianças autistas mostraram uma correlação sorológica entre MPR e autoimunidade cerebral, ou seja, mais de 90% dos soros autistas positivos para anticorpos MPR também tinham autoanticorpos anti-MBP no cérebro. Esta é uma observação bastante intrigante a favor de uma conexão entre infecção atípica pelo sarampo e autismo; Infecção atípica geralmente se refere à infecção que ocorre na ausência de erupção cutânea. Uma infecção atípica do sarampo na ausência de erupção cutânea e sintomas neurológicos incomuns foi recentemente descrita para sugerir a existência de uma variante de VM em crianças e adultos [9]. À luz dessas novas descobertas, sugerimos que uma porcentagem considerável de casos autistas pode resultar de uma infecção atípica pelo sarampo que não produz erupções cutâneas, mas causa sintomas neurológicos em algumas crianças. A fonte desse vírus pode ser uma variante de VM ou a vacina MPR. Cientificamente, portanto, é instrutivo considerar essas duas possibilidades e descobri-las por meio de pesquisa experimental. Achamos que este é um problema de saúde pública extremamente importante, simplesmente porque alguns cientistas recentemente nos alertaram sobre o surgimento de uma VM mutante que causa doenças fatais em seres humanos [9]. Nesse caso, serão necessárias novas estratégias de vacinação para combater a infecção mutante pelo sarampo. Embora sejam necessárias mais pesquisas para estabelecer um papel patognomônico para MPR / MV, atualmente estamos explorando o papel da auto-imunidade induzida por vírus e nossa pesquisa futura visa caracterizar as bases moleculares da imunidade celular e humoral a antígenos virais em crianças com autismo.
fonte: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12145534
Tradução de Nicoletta Protti e Claudio Andreini Di Vita, Cliva Tuscany