Breve apresentação dos resultados

Apresentamos hoje um estudo muito importante sobre o seqüenciamento genômico da linha celular encontrado no Priorix Tetra da vacina quadrivalente MPRV (sarampo, rubéola, caxumba e varicela) e o da linha celular MRC-5 (que é declaradamente usado no desenvolvimento da própria vacina).

Resumindo os relatórios publicados anteriores: 

1. primeiro demonstramos como a quantidade de DNA presente na vacina mencionada estava bem acima do permitido;  
2. então verificamos que a linha celular é na verdade, o MRC-5 declarado; 
3. subseqüentemente procedemos a seqüenciamento do genoma da linhagem celular extraída diretamente da vacina, destacando mutações muito pesadas que acarretam a possibilidade de sérios riscos à saúde no uso desta vacina.

O que apresentamos aqui é precisamente o trabalho de comparação entre os dois genomas: o que realmente encontramos na vacina e o do MRC-5 adquirido no banco de dados da ATCC.

O resultado é que as duas linhas apresentam diferenças importantes do ponto de vista da estabilidade genética. Em particular, o genoma da vacina parece estar fortemente modificado em comparação com o da linhagem celular depositada em 1966.

Isso significa que os produtores, neste caso do Priorix tetra, adquiriram a linha celular em condições ideais do ponto de vista da estabilidade genética e, com o uso contínuo ao longo do tempo para fins de produção, colocaram no mercado vacinas contendo material genético humano progressivamente. cada vez mais modificado e perigoso para a saúde dos vacinados. 

Como as agências reguladoras não exigem controle periódico da estabilidade genética das linhas fetais e nem mesmo estabelecem um limite mínimo de segurança, podemos deduzir que um requisito fundamental para a qualidade e segurança das vacinas que foram obtidos a partir de linhas celulares humanas, ou seja, a necessidade de verificar se não adquirem mutações e rearranjos potencialmente perigosos e garantir a eliminação de resíduos de processamento de material genético, se presentes.

Não cabe a nós identificar qual parte do processo de produção ou conservação pode afetar a qualidade e a segurança do produto, mas o que podemos testemunhar hoje ao publicar este relatório é que é urgente que os órgãos de controle realizem um exame minucioso dos resultados que nossas análises destacaram. nesses dois anos, concentrando a atenção no produto acabado, vendido e administrado, e não apenas nos "ingredientes" autorizados individuais.

Lembre-se mais uma vez que esses produtos fazem parte do calendário de vacinação italiano e atualmente são administrados compulsoriamente na população pediátrica do nosso país, bem como em outros países europeus e em geral em todo o mundo.

Os órgãos de controle têm uma enorme responsabilidade pela segurança, que atualmente é anunciada em palavras, mas que, de fato, aparentemente, e como parece em nossas análises, não pode ser garantida e é de fato claramente desconsiderada.

Visualização circular de genomas (circos plot)

Uma representação gráfica dos dois genomas chamados 'circos plot' é mostrada abaixo.

Significado dos vários círculos concêntricos

1. O círculo externo (o primeiro círculo) é o número do cromossomo.
2. O segundo toque (azul) representa a cobertura das leituras no estilo do histograma. Cada histograma é a cobertura média de uma área de 0,5 Mbp.
3. O terceiro anel (preto) representa a densidade dos INDELs no estilo 'gráfico de dispersão'. Cada ponto preto é calculado como o número de INDELs (pequenas inserções / exclusões) em um intervalo de 1 Mbp.
4. O quarto anel (verde) representa a densidade snp no estilo 'gráfico de dispersão'. Cada ponto verde é calculado como o número de SNPs (variantes de nucleotídeo único) em um intervalo de 1 Mbp.
5. O quinto anel representa a proporção de SNP de homozigose (laranja) e heterozigose (cinza) no estilo de histograma. Cada histograma é calculado a partir de uma região de 1 Mbp.
6. O sexto toque representa a inferência da CNV (variantes no número de cópias). Vermelho significa ganhar pedaços de DNA e verde significa perda.
7. O anel mais central representa a inferência de SV (variantes estruturais) nas regiões exônicas e de união. ENTRE (laranja, translocações), INS (verde, inserções), DEL (deleções, cinza), DUP (duplicações, rosa) e INV (inversões, azul).

conclusões

Os dois genomas mostram diferenças importantes. Em particular, o genoma da vacina acaba sendo fortemente alterado em comparação com o da linhagem celular depositada em 1966. Deve-se dizer que não tivemos a possibilidade de sequenciar a linhagem usada pela GlaxoSmithKline para a produção da vacina Priorix Tetra, mas a do estoque originais. As empresas farmacêuticas que utilizam linhas celulares para a produção de medicamentos e vacinas têm sua linha MRC-5, mas isso não muda nossas suspeitas, ou seja, o fato de que o controle da estabilidade genética não é necessário periodicamente e isso é muito sério em nossa opinião. , acima de tudo, porque ele pode estar presente sem limite.

Download: CORVELVA-comparador-humano-genoma-Priorix-Tetra-e-linha-MRC-5.pdf

Comparação entre o genoma humano contido no Priorix Tetra e na linha celular MRC-5 (padrão ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

A presença do vírus da rubéola foi demonstrada sequenciando uma biblioteca de RNA-seq extremamente profunda (aproximadamente 260 milhões de seqüências de Illumina produzidas). Foram detectadas 114 de 260 milhões de sequências, iguais a 0.00004% da sequência total. As sequências do genoma da rubéola foram então confirmadas manualmente com o software BLAST (Ferramenta básica de busca de alinhamento local, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). A biblioteca sequenciada em uma profundidade mais baixa (cerca de 12 milhões de seqüências pareadas Illumina, iguais a 6 milhões de fragmentos de biblioteca sequenciada) não havia detectado a presença de QUALQUER leitura atribuível à rubéola nesse lote.

As seqüências dos outros vírus presentes na vacina (varicela, sarampo e caxumba) também foram validadas da mesma maneira manual, confirmando que foram atribuídas corretamente.

Introdução

Os seqüenciadores da nova geração tornaram-se instrumentos de escolha para análises aprofundadas no campo da biologia e da medicina, especialmente o de precisão. Essas ferramentas permitem uma abordagem nova e mais global para uma série de aplicações como sequenciamento de novo, metagenômica, epigenômica, sequenciamento de transcriptoma e sequenciamento de genoma.

Esta última aplicação (re-sequenciamento) é difundida no campo humano, tanto para fins de pesquisa quanto para diagnóstico, e consiste no sequenciamento com a tecnologia NGS (Next Generation Sequencing) de um genoma individual inteiro para mapear mutações de nucleotídeo único (SNP, snip de pronúncia) '), inserções e deleções de sequências mais ou menos longas ocorreram em certas posições do genoma e variações no número de cópias de partes de genoma / genes (CNV, Copy Number Variants).

O procedimento de seqüenciamento exige que o DNA de um indivíduo seja mecanicamente quebrado em pequenos fragmentos (400-500 pares de bases) e trechos de DNA artificial chamados adaptadores sejam ligados aos fragmentos, o que permite a ligação dos fragmentos de DNA humano a uma superfície de vidro na qual as bases são então lidas (A, C, G, T). As bases do DNA são lidas incorporando reações químicas de nucleotídeos marcados com moléculas fluorescentes. Os milhões de sequências (leituras) obtidas a partir do sequenciamento na superfície do vidro são então mapeadas no genoma de referência humano com software apropriado e, em seguida, todas as variantes presentes no genoma analisado em comparação com a referência são identificadas.

Este mesmo procedimento foi realizado no genoma humano presente no lote Priorix Tetra. n. A71CB256A e no DNA extraído da linha celular MRC-5, depositada em 1966 na ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

A ATCC é a organização líder mundial de recursos e padrões de materiais biológicos cuja missão se concentra na aquisição, autenticação, produção, armazenamento, desenvolvimento e distribuição de microrganismos de referência, linhas celulares e outros materiais biológicos padrão. Foi criado em 1925, quando um comitê de cientistas reconheceu a necessidade de uma coleção centralizada de materiais biológicos que poderiam servir cientistas em todo o mundo.

A linha celular MRC-5 é derivada do tecido pulmonar normal de um feto masculino de 14 semanas de idade e foi depositada no ATCC por JP Jacobs em setembro de 1966. Diz-se que essas células são capazes de duplicar 42 a 46 populações antes do início. de senescência. O artigo de referência para esta linha de células remonta a 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0

Resultados

Como mostrado anteriormente, o DNA humano presente no lote Priorix Tetra. n. A71CB256A (indicado nos gráficos a seguir como amostra ID12051PT) é um genoma individual completo, ou seja, existe DNA genômico de todos os cromossomos de um indivíduo do sexo masculino. Os gráficos de cobertura (profundidade média = cobertura média) dos 22 cromossomos humanos e dos cromossomos X e Y são mostrados abaixo, para a vacina (imagem acima) e a linha celular MRC5 (imagem abaixo).

Os resultados da análise dos vários tipos de variantes são mostrados abaixo.

Variantes de nucleotídeo único (SNP) e inserções / deleções curtas (InDels)

As variantes de bases únicas de DNA (SNP, pronunciado "snip") são polimorfismos, ou seja, variações do material genético, carregadas por um único nucleotídeo. Os 'InDels', por outro lado, são pequenas inserções e deleções com menos de 50 pb de comprimento e constituem outra classe de variantes genômicas no genoma humano.

SNP (variantes de nucleotídeo único) - ID12051PT

SNP (variantes de nucleotídeo único) - MRC-5

INDELs (pequenas inserções / exclusões) - ID12051PT

INDELs (pequenas inserções / exclusões) - MRC-5 

CNV (variantes do número de cópias) e SV (variantes estruturais)

Variantes no número de cópias (CNV) são variantes genômicas devido a variações no número de cópias de fragmentos relativamente grandes (maiores que 50 pb) entre genomas individuais. Existem dois tipos de CNV: tipo 'ganho' (ganho de cópia) e tipo 'perda' (perda de cópias).

Variantes estruturais (SV) são variantes genômicas com tamanhos relativamente grandes (> 50 bp), incluindo deleções, duplicações, inserções, inversões e translocações.

CNV (variações no número de cópias)

SV (variantes estruturais)

Visualização circular de genomas (circos plot)

Uma representação gráfica dos dois genomas chamados 'circos plot' é mostrada abaixo.

Significado dos vários círculos concêntricos

1. O círculo externo (o primeiro círculo) é o número do cromossomo.
2. O segundo toque (azul) representa a cobertura das leituras no estilo do histograma. Cada histograma é a cobertura média de uma área de 0,5 Mbp.
3. O terceiro anel (preto) representa a densidade dos INDELs no estilo 'gráfico de dispersão'. Cada ponto preto é calculado como o número de INDELs (pequenas inserções / exclusões) em um intervalo de 1 Mbp.
4. O quarto anel (verde) representa a densidade snp no estilo 'gráfico de dispersão'. Cada ponto verde é calculado como o número de SNPs (variantes de nucleotídeo único) em um intervalo de 1 Mbp.
5. O quinto anel representa a proporção de SNP de homozigose (laranja) e heterozigose (cinza) no estilo de histograma. Cada histograma é calculado a partir de uma região de 1 Mbp.
6. O sexto toque representa a inferência da CNV (variantes no número de cópias). Vermelho significa ganhar pedaços de DNA e verde significa perda.
7. O anel mais central representa a inferência de SV (variantes estruturais) nas regiões exônicas e de união. ENTRE (laranja, translocações), INS (verde, inserções), DEL (deleções, cinza), DUP (duplicações, rosa) e INV (inversões, azul).

conclusões

Os dois genomas mostram diferenças importantes. Em particular, o genoma da vacina acaba sendo fortemente alterado em comparação com o da linhagem celular depositada em 1966. Deve-se dizer que não tivemos a possibilidade de sequenciar a linhagem usada pela GlaxoSmithKline para a produção da vacina Priorix Tetra, mas a do estoque originais. As empresas farmacêuticas que utilizam linhas celulares para a produção de medicamentos e vacinas têm sua linha MRC-5, mas isso não muda nossas suspeitas, ou seja, o fato de que o controle da estabilidade genética não é necessário periodicamente e isso é muito sério em nossa opinião. , acima de tudo, porque ele pode estar presente sem limite.