Vogliamo fare il punto della situazione, insieme a voi. Da luglio 2018 a oggi sono passati 8 mesi e in questi mesi abbiamo raggiunto risultati estremamente soddisfacenti. Abbiamo presentato un programma di ricerca e per quanto riguarda l’analisi dei vaccini siamo in grado di fare un primo punto della situazione, con gli obiettivi raggiunti, quelli in fase di completamento e quelli ancora in programma.

Iniziamo questo aggiornamento col dire che sono state confermate le analisi, mediante standard, di 2 composti per ogni vaccino, utilizzando standard di controllo certificati con una concentrazione nell'ordine dei microgrammi/mL. I composti da noi scelti sono tra quelli noti per il loro profilo critico di pericolosità. Parliamo di una quantità cumulativa, cioè in totale tra quelli confermati come identità e quelli da indentificare, che è possibile stimare dell’ordine dei 50 microgrammi/mL, in contrasto con le linea guida dell'EMA/FDA.

Queste conferme hanno dato esito positivo, pertanto confermano interamente la metodica di analisi! Le contaminazioni osservate sono probabilmente dovute a fenomeni e variabili associati al processo di lavorazione. Ciò che è stato osservato nel corso degli studi è una variazione interlotto di tale composizione che porta a presupporre che esistano processi difficilmente controllabili all'interno dell'iter complessivo di lavorazione del prodotto.

Le analisi effettuate hanno permesso di concludere i seguenti step:

• Valutazione della conformità della composizione come indicato nella scheda tecnica dei vaccini
• Screening delle contaminazioni chimiche, proteiche/peptidiche e di materiale genetico
• Studio di conferma di composti target (chimici e proteici) con standard certificati di controllo

Sono stati analizzati i seguenti vaccini in maniera “completa”:

• Infanrix Hexa - GlaxoSmithKline Biologicals s.a.
• Priorix Tetra - GlaxoSmithKline S.p.A.
  
• Hexyon - Sanofi Pasteur Europe
• Gardasil 9 - MSD Vaccins

Sono stati analizzati questi altri vaccini come screening iniziale:

• Measles vaccine live B.P. - Poonawalla Group (Profarma AG, Baar)
• MMR vax Pro - MSD Vaccins, Francia
• PolioInfanrix - GlaxoSmithKline, Belgio
• Fluad -  Seqirus Srl, Siena
• Vivotif - PaxVax, Regno Unito

Tecnologie utilizzate

Lo studio si è articolato su:

Analisi delle impurezze e contaminazioni chimiche e proteiche

• Il sistema di analisi LC-SACI/ESI-MS associato all’innovativa piattaforma SANIST è stato utilizzato sia per eseguire un primo screening identificativo sui vaccini di interesse, che per la conferma con gli standard di controllo, con un limite minimo tra i nanogrammi e i microgrammi/dose
• La tecnologia MALDI-TOF-MS è stata utilizzata per studiare le macromolecole insolubili presenti nei vaccini

Analisi del materiale genetico

• Test di presenza di acidi nucleici (DNA/RNA) di origine umana e animale e da microrganismi (virus, batteri) utilizzando la metodica Next Generation Sequencing, che ha permesso di quantificare in maniera altamente specifica e accurata la sequenza del materiale genetico contenuto nei vaccini esaminati

Analisi quantitativa dei metalli

• la tecnologia ICP-MS ha permesso di quantificare i metalli presenti nei vaccini con un limite minimo di 5ng/dose.

Analisi delle contaminazioni chimiche e proteiche

Dopo un primo screening che aveva individuato la presenza di centinaia di segnali chimici all’interno dei vaccini, sono state eseguite le conferme mediante standard di 2 composti per vaccino, utilizzando standard di controllo certificati, scelti tra quelli noti per il loro profilo critico di pericolosità e per la quantità non residuale (tale da poter essere considerati dei componenti dei vaccini, quindi da inserire in scheda tecnica e quantificati).

Queste conferme hanno dato esito positivo, pertanto confermano interamente la metodica di analisi. Per ora sono state effettuate su soli due composti per motivi prettamente economici, questo studio infatti non è esaustivo perché limitato dal costo notevole dell’indagine ma abbiamo scelto di  identificare gli standard che hanno maggiore impatto a livello di limitazioni normative ed è altresì vero che non spetterebbe a noi questo tipo di indagine così approfondita.

Le contaminazioni osservate sono probabilmente dovute a fenomeni e variabili associati al processo di lavorazione. Ciò che è stato osservato nel corso degli studi è una variazione interlotto di tale composizione che porta a presupporre che esistano processi difficilmente controllabili all'interno dell'iter complessivo di lavorazione del prodotto. Considerando i soliti fattori analitici si può ipotizzare che la concentrazione sia nell'ordine dei microgrammi/mL. Per quanto riguarda la quantità cumulativa è possibile stimare sulla base di una valutazione semiquantitativa (in quanto la maggior parte dei composti non sono noti) che i contaminanti siano dell’ordine dei 50 μg/mL. Questo dato è importante perchè le linea guida dell'EMA/FDA è chiara in proposito. Le contaminazioni non devono essere presenti (sotto il limite di rivelabilità) o se lo sono vanno ben caratterizzate e dimostrato di applicare metodiche appropriate per ridurle il più possibile. Nel nostro caso i contaminanti che abbiamo trovato non sono sotto il limite di rivelabilità dello strumento (ng/mL) e quindi a nostro avviso il produttore non sta applicando alcuna metodiche di purificazione. Per quanto riguarda la presenza di virus avventizi il problema non sussiste, perchè devono essere assenti del tutto.

• IN CORSO - Sono in corso le analisi di conferma interlaboratorio di questi composti.
  I composti identificati mediante standard saranno riconfermati con la medesima tecnologia in altri laboratori. Uno dei target che ci siamo prefissati è coordinare questa azione anche mediante il supporto di associazioni internazionali.
• IN CORSO - Studio della cinetica di precipitazione degli antigeni legati all’alluminio.

Analisi metagenomiche

• IN CORSO - Analisi con ulteriori standard di controllo del DNA e dell’RNA di un altro lotto per vaccino.
  Dall’inizio di questo progetto ci è stato chiaro che le analisi, per rispondere ai requisiti necessari della replicabilità e accuratezza del dato, dovessero essere effettuate con strumentazione d’avanguardia, e monitorando le eventuali differenze intralotto e tra lotti diversi. Mentre procediamo con le indagini, vengono continuamente analizzati altri lotti, ovviamente limitatamente ai costi e alla reperibilità dei prodotti.
• IN CORSO - Analisi di sequenziamento del genoma del DNA fetale proveniente dalla linea cellulare MRC-5.
  Già nel primo screening avevamo avuto modo di confermare mediante standard che le linee diploidi utilizzate erano MRC-5, come dichiarato in scheda tecnica. Vogliamo approfondire lo studio di questa linea cellulare anche in virtù del fatto che è presente in quantitativi notevoli e di dimensioni assolutamente considerevoli.
• IN CORSO - Studio delle varianti minori (quasispecie) dei virus del morbillo, parotite e rosolia.
  Rispetto al primo report di luglio 2018 (https://goo.gl/cSspVH) abbiamo commissionato lo studio approfondito delle varianti minori poiché le mutazioni dei virus attenuati vaccinali non erano le uniche riscontrate. Anche questo elemento pone enormi dubbi riguardo l’efficacia e la sicurezza del vaccino. Il risultato richiederà più tempo rispetto agli altri report perché la verifica delle sequenze dei vari mutanti deve essere fatta manualmente.
• IN CORSO - Analisi di conferma interlaboratorio
  Abbiamo identificato laboratori esteri e nazionali a cui abbiamo commissionato la replica delle analisi mediante standard. Tale risultato sarà disponibile entro breve.

Progetti in fase di valutazione

Studio della potenza degli antigeni vaccinali: tale studio deve essere svolto presso un centro accreditato dalle agenzie regolatorie per lo studio preclinico dei vaccini. Lo scopo è di verificare se gli antigeni vaccinali siano in grado di produrre o di legarsi ad anticorpi specifici (si assume teoricamente che questi anticorpi siano protettivi, ma questa analisi non permette di dimostrare che il vaccino è in grado di proteggere dalla malattia). Il costo di questo passaggio potrebbe essere notevole, pertanto il progetto è per ora ipotetico.

Download: CORVELVA-Resoconto-dei-risultati-ottenuti.pdf