Vi descriviamo alcuni punti che ci preoccupano, vi anticipiamo che quando abbiamo iniziato queste analisi, dalle metagenomiche alle attuali chimiche, avevamo tante domande e cercavamo solo risposte... con i primi risultati abbiamo ancora più domande e soprattutto preoccupazioni!

L’indagine quali-quantitativa di composti organici riveste molta importanza in campo farmacologico. Esistono potenziali problemi di sicurezza derivanti dai nuovi processi di produzione e dalle complesse caratteristiche strutturali e biologiche dei prodotti.

Ne segue che nel vaccino sono state riscontrate:

• Contaminazioni chimiche provenienti dal processo di lavorazione o da contaminazioni crociate con altre linee di produzione
• Tossine chimiche
• Tossine peptidiche batteriche
• Macromolecola insolubile e indigeribile che reagisce al saggio per le proteine, ma non viene riconosciuta dalle banche dati delle proteine

Non è stata riscontata la presenza di:

• Antigeni proteici dei tossoidi della difterite, tetano, pertosse, epatite B, Haemophylus influenzae B, Poliomielite 1-2-3
• Formaldeide e glutaraldeide, fenossietanolo, residui di antibiotici indicati nella composizione

Gli antigeni presenti nel vaccino Infanrix Hexa sono sei: i tossoidi del tetano, difterite e pertosse, gli antigeni D dei tre virus della poliomielite, le proteine ottenute mediante ingegneria genetica per l’epatite B e i polisaccaridi dell’haemophylus legati chimicamente al tossoide del tetano come carrier. Per formare i tossoidi è necessario un trattamento con formaldeide e glutaraldeide che dovrebbe consentire di eliminare la tossicità mantenendo integra la loro capacità di stimolare anticorpi protettivi contro le tossine originali.

Ció che ci aspettavamo di trovare erano i tre tossoidi e gli altri antigeni non modificati dai trattamenti con formaldeide e glutaraldeide, separabili tra loro e digeribili dall’enzima specifico per le proteine (tripsina). È stato invece trovato un vero e proprio polimero, insolubile e indigeribile, costituito dall’'insieme degli antigeni legati chimicamente tra loro (da definire se presente come aggregato dei singoli antigeni o un’unica macromolecola), sul quale risultano informazioni anche in letteratura per singoli antigeni. ^1-2
Questa macromolecola non è stata in alcun modo riconosciuta dalle banche dati delle proteine, e quindi di fatto risulta essere un composto solido di struttura chimica sconosciuta.

La solubilità delle proteine e la possibilità di digerirle (cioè tagliarle in piccoli frammenti peptidici) sono le due caratteristiche tipiche delle proteine, che ci permettono non sono di studiarle con le metodiche per l’analisi delle proteine ma anche sono un requisito necessario per l’interazione con il sistema immunitario per la formazione di anticorpi protettivi, perché se la struttura di una proteina viene modificata profondamente rispetto a quella originale anche gli anticorpi che si formano sono completamente diversi da quelli che sono in grado di attaccare gli antigeni originali che causano le malattie.

Poiché questo polimero che abbiamo incontrato, derivato dal mix di antigeni, non è solo diverso dal punto di vista della conformazione spaziale ma soprattutto è diverso dal punto di vista chimico, possiamo affermare che non siamo in presenza di antigeni simili a quelli originali ma a un composto con tossicità ed efficacia non note ed imprevedibili.

Oltre a non essere stati di fatto rilevati gli antigeni vaccinali, sono stati riscontrati 65 segnali di contaminanti chimici di cui il 35% noto, cioè riconosciuto per confronto con le banche dati; tra questi troviamo vari residui di lavorazione, e contaminazioni crociate da altre linee di produzione, la cui identificazione andrà verificata nell’approfondimento analitico di secondo livello (cioè con standard di controllo).

Tra questi segnali sono state identificate anche 7 tossine chimiche, probabilmente provenienti dal processo di lavorazione degli antigeni o da altri processi di produzione presenti nella sede di produzione del vaccino; tali tossine non ancora definite in maniera univoca nella struttura, sembrano in parte derivare dalla reazione della formaldeide, glutaraldeide, e bromuro di cianogeno con altri contaminanti chimici presenti nel vaccino. Si sottolinea che gran parte di queste tossine hanno una tossicità accertata e pubblicata in Pubchem ³ o Toxnet ⁴ e pongono un problema significativo di sicurezza.

Dallo studio della frazione proteica e peptidica sono risultati vari peptidi liberi (cioè frammenti corti di catene di aminoacidi) di origine batterica, che provengono quindi dalle cellule batteriche di coltura per l’estrazione degli antigeni. I peptidi batterici sono riportati in letteratura come potenziali allergeni ⁵ e capaci di indurre reazioni autoimmuni ⁶ e anche questi pongono un problema di sicurezza che andrà chiarito con le agenzie regolatorie.

Tornando ai due pilastri portanti che ci hanno fatto iniziare questo percorso di analisi e ribadendo il concetto espresso dalla recente intervista sulla prestigiosa rivista scientifica Nature: noi stiamo indagando l’efficacia e la sicurezza dei vaccini e in realtà ci risulta difficile capire come sia possibile affermare che questo vaccino sia in grado di formare anticorpi protettivi contro le sei malattie per le quali ci si protegge e ci risulta ancora più difficile capire come possa essere stabilito che questo ammasso non sia tossico nei neonati visto che si tratta di ben 6 antigeni neurotossici legati insieme.

L'esavalente Infanrix hexa, per la metodica da noi commissionata, lascia enormi dubbi sia sulla sua efficacia che sulla sua sicurezza…

Noi assicuriamo una cosa: non ci fermeremo.

 Download: CORVELVA-Report-analisi-composizione-chimica-Infanrix-Hexa.pdf

Riferimenti

1. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2017 Jun 1;1054:80-92 - The combined use of analytical tools for exploring tetanus toxin and tetanus toxoid structures.
2. Vaccine. 2007 Mar 8;25(12):2213-27. - Investigation of the detoxification mechanism of formaldehyde-treated tetanus toxin.
3. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/
4. https://toxnet.nlm.nih.gov/
5. Int J Med Microbiol. 2018 Aug;308(6):738-750. - The quest for bacterial allergens.
6. Front Microbiol. 2017 Oct 9;8:1938 - Morbid Sequences Suggest Molecular Mimicry between Microbial Peptides and Self-Antigens: A Possibility of Inciting Autoimmunity.

Approfondimenti

Il vaccino Infanrix Hexa presenta la seguente composizione, copiamo fedelmente dalla scheda tecnica presente secondo scheda tecnica del produttore:

La preparazione degli antigeni sotto riportata è quella indicata nel report dell’EMA per l’autorizzazione all’immissione in commercio di Infanrix Hexa. ¹

Tossoide difterico: Il tossoide difterico si ottiene inattivando la tossina (prodotta da Corynebacterium diphtheriae) con formaldeide a 37°C in ambiente leggermente alcalino e poi viene adsorbito su sali di alluminio (idrossido e fosfato)

Tossoide tetanico: Il tossoide tetanico si ottiene con lo stesso procedimento del tossoide difterico (il Clostridium tetani è un batterio sporigeno anaerobio obbligato e produce la tetanospasmina, una tossina neurotropa che agisce attraverso il blocco delle sinapsi inibitorie della contrazione muscolare riflessa)

Tossoide pertussico: i componenti del vaccino antipertosse acellulare sono ottenute per estrazione e purificazione di colture di fase I di Bordetella pertossis (un coccobacillo aerobio, in grado di produrre quattro tossine: la tossina della pertosse, la tossina adenilato-ciclasica, la tossina dermonecrotica, la citotossina tracheale e due tipi di lipopolisaccaride; per la preparazione del vaccino acellulare si purifica e utilizza solo la tossina della pertosse), seguita da detossificazione irreversibile della tossina della pertosse tramite trattamento con glutaraldeide e formaldeide e trattamento con formaldeide delle componenti emoagglutinina filamentosa e pertactina; i vari componenti sono poi adsorbiti su sali di alluminio.

Antigene di superficie dell’epatite B: è prodotto da colture di Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificato che codifica per il gene dell’antigene maggiore di superficie del virus dell’epatite B; tale antigene viene purificato mediante vari passaggi chimico-fisici e si assembla spontaneamente in particelle sferiche di circa 20 nm di diametro contenenti l’antigene polipeptidico e una matrice fosfolipidica. Tale antigene viene poi adsorbito su fosfato di alluminio.

Virus della poliomielite (inattivati): il vaccino Salk, o polio inattivato (IPV), si basa su tre ceppi selvaggi, virulenti di riferimento: Mahoney (poliovirus di tipo 1), MEF-1 (poliovirus di tipo 2), e Saukett (poliovirus tipo 3), coltivati nella linea cellulare VERO: si tratta di una linea cellulare immortalizzata ottenuta nel 1962 dai reni di scimmie africane adulte (cercopitechi); per la produzione del vaccino le cellule vengono sottoposte a 130-140 passaggi di propagazione, (basso livello di propagazione), si tenga presente che oltre i 200 passaggi la linea cellulare diventa cancerogena nei topi; il terreno di coltura per la crescita della linea VERO è di derivazione animale (e quindi va testato per la presenza di virus e prioni contaminanti), mentre per la crescita del virus si usa  il Medium 199, il quale non contiene sostanze di derivazione animale. Dopo essere stati isolati e purificati i virus vivi vengono inattivati con formaldeide.
Da quanto reso noto dall’EMA, nel vaccino non si trovano i virus tal quali, ma le proteine prodotte dai tre ceppi, denominate Antigene D; queste proteine si formano prima del trattamento con formaldeide e glutaraldeide che ha la funzione di inattivare i tossoidi, e di distruggere tutto il materiale genetico, proveniente dalle cellule Vero, potenzialmente cancerogeno, ma anche quello dei virus della poliomielite.

Polisaccaride dell’Haemophilus influenzae tipo b: è preparato dal ceppo batterico Hib 20,752 (esistono ceppi non capsulati, non tipizzabili, e ceppi capsulati, antigenicamente distinti in 6 tipi diversi denominati con le lettere dell'alfabeto dalla a alla f. Le infezioni più frequenti e meno gravi provocate dall'Hib sono quelle che interessano le prime vie respiratorie, e sono sostenute usualmente da ceppi non capsulati. Le infezioni invasive, come le meningiti sono invece causate prevalentemente da ceppi capsulati, soprattutto di tipo b)
Il polisaccaride si ottiene dalla crescita del ceppo batterico in un medium di coltura sintetico e dopo attivazione con bromuro di cianogeno e derivatizzazione con uno spaziatore idrazide-adipico viene accoppiato con il tossoide tetanico via condensazione carbamidica; dopo la purificazione il coniugato è adsorbito su sali di alluminio e poi è liofilizzato in presenza di lattosio come stabilizzatore. La coniugazione con il tossoide del tetano è necessaria per conferire l’antigenicità al polisaccaride in quanto cambia il polisaccaride da antigene T-indipendente ad antigene T-dipendente.

Prodotto Finito: i concentrati sterili assorbiti su alluminio di DT, PT, FHA, PRN, e HBsAg e il componente trivalente di IPV vengono mescolati con una soluzione sterile di cloruro di sodio e acqua per iniettabili e addizionati di una soluzione sterile di 2-fenossietanolo.
Il 2-fenossietanolo è un agente antimicrobico e viene aggiunto al prodotto finito perchè non è possibile eseguire la sterilizzazione finale mediante filtrazione della componente DTPa-HBV-IPV e l’opalescenza della sospensione potrebbe mascherare una contaminazione microbica.